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作者：

杨怿

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摘要：

α2-肾上腺素受体(α2-Adrenoceptor,α2-AR)是经典的肾上腺素能受体之一,属A类G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCR)超家族,内源性配基为去甲肾上腺素(Noradrenaline,NE)和肾上腺素(Epinephrine),广泛分布在外周组织和中枢神经系统中,参与介导多种生理功能,如镇痛,镇静,降低血压和体温等,是药物开发的重要靶点.右美托咪啶(Dexmedetomidine,DMED)为α2-AR激动剂,其镇静作用与生理性睡眠相似,在临床麻醉以及ICU的镇静中广泛应用.α2-AR的三个亚型α2A-AR,α2B-AR和α2C-AR,在体内分布明显不同,并且每个亚型介导哪些生理功能尚不完全清楚.右美托咪啶激活α2-AR后引起的镇静作用是否具有亚型特异性?右美托咪啶激活α2-AR受体后与Gαi蛋白偶联,引起一系列下游信号通路的变化,这些变化的受体后信号通路与镇静作用又有何联系?为了回答这些问题,本课题开展如下研究.研究目的:明确α2-AR受体激活后发挥镇静作用的关键受体亚型及参与镇静作用的主要受体后信号通路.研究内容:1,在细胞水平上,建立α2-AR受体亚型药物筛选模型,并对多种α2-AR激动剂或拮抗剂进行药效学评价;在整体水平上,探究DMED激动α2-AR后发挥镇静作用与受体亚型的相关性.2,在整体水平上,探究DMED激动α2-AR后发挥镇静作用的信号通路机制.研究方法:1,构建pc DNA3.1/Hygro-HA-α2A-AR及pc DNA3.1/Hygro-HA-α2C-AR重组质粒,转染至CHO-PKAcat-EGFP细胞中,以潮霉素B(200 mg/L)进行压力筛选后,采用PKA重分布实验筛选阳性克隆,建立CHO-PKAcat-α2A-AR及CHO-PKAcat-α2C-AR稳定转染细胞株,通过计算阳性克隆Z'因子,验证模型可靠性.2,通过实时定量PCR(q RT-PCR)法验证细胞模型中两个受体亚型在转录水平的表达量,放射性配体结合实验检测受体蛋白表达丰度,最后以时间分辨荧光共振能量转移免疫实验检测细胞c AMP含量以鉴定α2-AR受体亚型的功能.3,在CHO-PKAcat-α2A-AR及CHO-PKAcat-α2C-AR两个细胞模型上,用PKA重分布实验对α2-AR的七种激动剂DMED,美托咪啶(Medetomidine,MED),可乐定,NE,胍法辛,赛拉嗪,莫索尼定以及六种拮抗剂阿替美唑(Atipamezole,ATI),BRL44408,JP-1302,ARC239,哌唑嗪进行药效学评价.4,通过小鼠翻正反射消失(Loss of righting reflex,LORR)模型,小鼠自发活动模型评价静脉给予DMED的镇静作用.观察小鼠侧脑室注射不同的α2-AR拮抗剂阿替美唑,BRL44408,JP-102,ARC239对DMED镇静作用的影响.5,评价α2-AR不同激动剂DMED,可乐定,胍法辛和赛拉嗪对小鼠自发活动的影响;通过麻醉大鼠在体检测DMED,可乐定,胍法辛和赛拉嗪对大鼠血压及心率的影响,排除血压对自发活动的影响.在小鼠翻正反射及自发活动模型上,观察小鼠侧脑注射c AMP类似物二丁酰c AMP钠盐(Dibutyryl-c AMP,dbc AMP)以及内向整流钾通道阻断剂Tertiapin-Q三氟乙酸盐(Tertiapin-Q trifluoroacetate salt,T-Q)对DMED镇静作用的影响.研究结果:1,酶切鉴定与基因测序证明pc DNA3.1/Hygro-HA-α2A-AR及pc DNA3.1/Hygro-HA-α2C-AR重组质粒构建成功.重组质粒转染细胞后,PKA重分布实验筛选出反应性良好的CHO-PKAcat-α2A-AR 7号克隆及CHO-PKAcat-α2C-AR 60号克隆,两株细胞的Z'因子经多次重复试验均在0.5~1之间,证明CHO-PKAcat-α2A/2C-AR稳定转染细胞模型可靠性良好.2,α2A-AR及α2C-AR的m RNA含量在CHO-PKAcat-α2A/2C-AR稳定转染细胞株多次传代后保持稳定的较高水平;CHO-PKAcat-α2A-AR细胞中,[3H]RX821002与α2A-AR结合的Bmax值和Kd值分别为(4.92±5.27)pmol/mg和(12.67±11.16)n M;CHO-PKAcat-α2A-AR细胞中,Forskolin(10μM)可明显增加胞内c AMP含量,DMED(10-6~10-4 M)作用后可显著抑制forskolin的作用.Forskolin(10μM)作用于CHO-PKAcat-EGFP及CHO-PKAcat-α2C-AR细胞后,c AMP明显增加,DMED(10-8~10-4 M)作用后有剂量依赖的降低CHO-PKAcat-α2C-AR细胞c AMP含量趋势,在DMED为10-4 M时与forskolin对照组有显著差异,表明激动剂能够激活CHO-PKAcat-α2A/2C-AR稳定转染细胞株的受体后通路,受体能够发挥正常功能.3,在CHO-PKAcat-α2A/2C-AR稳定转染细胞模型上,通过PKA重分布实验比较不同的α2-AR激动剂和拮抗剂对两受体的激动和拮抗作用,根据EC50或IC50值比较它们对两种亚型的选择性.七种激动剂对于两种受体均无明显选择性,其中DMED对两种受体的作用效能均强于其他激动剂;拮抗剂阿替美唑对两个亚型拮抗作用较强且无选择性,而BRL44408则表现出了明显的α2A-AR选择性(IC50=242.30±26.00 n M),JP-1302对α2C-AR具有选择性(IC50=2813.00±521.64n M),ARC239在浓度为10-5 M时能够拮抗DMED对α2C-AR的作用.4,DMED(0.1~0.22 mg/kg,i.v)可剂量依赖性地引起小鼠翻正反射消失,ED50=0.12 mg/kg,ED100=0.22 mg/kg,不同剂量组对诱导时间的影响无显著差异,制动时间有剂量依赖性延长的趋势,但无统计学意义;DMED可以剂量(0.000391~0.1 mg/kg)依赖性地抑制小鼠自发活动,其中,0.00625~0.1 mg/kg剂量下与空白对照组相比有显著性差异.以DMED(0.25 mg/kg,i.v)建立小鼠翻正反射消失模型,ATI(0.05~1μg/只,i.c.v)可以剂量依赖性地拮抗DMED致小鼠翻正反射消失的作用;α2A-AR选择性拮抗剂BRL44408(2.5~20μg/只,i.c.v)也可以剂量依赖地拮抗DMED的作用,各剂量对诱导时间的影响无明显统计学差异,但可以显著降低制动时间;α2C-AR选择性拮抗剂ARC239(48μg/只),JP-1302(88μg/只)脑室给药不能拮抗DMED的作用.以DMED(0.0125mg/kg,i.v)建立小鼠自发活动抑制模型,ATI(0.2,0.8,3.2μg/只,i.c.v)单独给药对小鼠自发活动无影响,0.8及3.2μg/只剂量均可以显著拮抗DMED对小鼠的自发活动抑制作用;BRL44408(2.5,5,10μg/只,i.c.v)对小鼠自发活动有剂量依赖的抑制趋势,但无显著性差异,5μg/只剂量组可以显著拮抗DMED的作用,10μg/只剂量组不能拮抗DMED的作用,自身有抑制自发活动的作用;JP-1302(5.5,22,88μg/只,i.c.v)对小鼠自发活动有抑制的趋势,但无统计学差异,对DMED抑制小鼠自发活动没有对抗作用;ARC239(3,12,48μg/只,i.c.v)对小鼠的自发活动有剂量依赖的抑制趋势,尤其48μg/只剂量下作用显著,但三个剂量也都无法拮抗DMED抑制小鼠自发活动的作用.5,DMED在0.05 mg/kg剂量下即可显著抑制小鼠自发活动,而可乐定,胍法辛和赛拉嗪镇静作用较弱,药效比较排序为DMED可乐定胍法辛≈赛拉嗪.DMED,可乐定,胍法辛及赛拉嗪对小鼠的自发活动抑制属于中枢抑制后产生的镇静作用,与血压降低无关.以DMED(0.20 mg/kg,i.v)建立小鼠翻正反射模型,dbc AMP(20~40μg/只,i.c.v)剂量依赖地抑制DMED的作用,40μg/只可完全抑制DMED诱导的翻正反射消失,各剂量组诱导时间无显著性差异,制动时间均明显低于DMED组;T-Q(250,300 pmol/只,i.c.v)显著抑制DMED的作用,各剂量组诱导时间无显著性差异,制动时间随剂量增加而逐渐降低.以DMED(0.0125 mg/kg,i.v)建立小鼠自发活动抑制模型,dbc AMP三个剂量(1.25,5,20μg/只,i.c.v)单独给药对小鼠自发活动有一定的抑制作用,且不能拮抗DMED的作用;T-Q(40,100,250 pmol/只,i.c.v)三个剂量虽然单独给药对小鼠自发活动无影响,但也不能拮抗DMED的作用,与翻正反射模型的结果矛盾,其原因有待进一步研究.结论:1,成功建立CHO-PKAcat-α2A-AR及CHO-PKAcat-α2C-AR稳定转染细胞模型.2,α2-AR拮抗剂BRL44408对α2A-AR具有选择性,JP-1302及ARC239对α2C-AR具有选择性.3,α2-AR可能主要通过α2A-AR亚型发挥镇静作用.4,AC-c AMP通路及内向整流钾通道可能参与介导α2-AR的镇静作用.

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关键词：

α_2-肾上腺素受体；受体亚型；镇静；信号通路

学位级别：

硕士

DOI：

CNKI:CDMD:2.1016.211676